Banca de DEFESA: TATIANE CASARIN

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: TATIANE CASARIN
DATA: 11/05/2020
HORA: 09:00
LOCAL: Videoconferência
TÍTULO:

Embriogênese somática e validação do sistema CRISPR/CAS9 em Coffea canephora

PALAVRAS-CHAVES:

Edição genômica, PDS, N-metiltransferase, clone 14, clone 22.

PÁGINAS: 93
GRANDE ÁREA: Ciências Agrárias
ÁREA: Agronomia
RESUMO:

Coffea canephora é a segunda espécie mais cultivada do gênero Coffea, representando cerca de 25% da produção brasileira sendo especialmente utilizada, na indústria do café solúvel e em blends com Coffea arabica. A espécie apresenta alta variabilidade genética, tendo os programas de melhoramento buscado a identificação, seleção e propagação de genótipos com características superiores. Entretanto o melhoramento convencional demanda muito tempo e a aplicação de ferramentas biotecnológicas pode ajudar a acelerar este processo. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram testar diferentes protocolos de indução de embriogênese somática direta para C. canephora visando a sua aplicação em trabalhos futuros de transformação genética, a validação da aplicação de uma estratégia multiplex do sistema CRISPR-Cas9 através do silenciamento do gene CcPDS, e a obtenção de plantas com redução do teor de cafeína através do silenciamento, via CRISPR-Cas9, dos genes XMT, MXMT e DXMT das enzimas de biossíntese da cafeína. Para a avaliação da indução de embriogênese direta foram utilizados explantes provenientes de folhas in vitro e de folhas de casa de vegetação de C. canephora clone 22, submetidos a três diferentes tratamentos de indução. O mais eficiente foi o Meio 3 (Priyono et al., 2010), com 96,25% de eficiência de indução e média de 33,99 embriões por explante de folhas in vitro e 67% de eficiência de indução e média de 66,93 embriões por explante de casa de vegetação. Em ambos experimentos de edição genômica, foram utilizados calos embriogênicos de C. canephora clone 14, seguindo o protocolo descrito por Ribas et al. (2011) e diferentes construções gênicas multiplex, nas quais os sgRNAs estavam sob a regulação de promotores U6 de C. canephora ou Arabidopisis thaliana. Plantas e embriões apresentando os fenótipos albino, variegado e verde foram obtidas na transformação com as construções contendo sgRNAs para o gene CcPDS, sendo que 71,4% das plantas avaliadas apresentaram algum tipo de mutação, sendo que 28,6% do total de mutações observadas foram em homozigose. Seis plantas possivelmente transformadas para o silenciamento dos genes de síntese de cafeína foram analisadas e cinco estavam efetivamente transformadas. Destas, apenas uma apresentou mutações nas regiões reconhecidas pelos sgRNAs, sendo uma mutação em heterozigose no segundo alvo do gene XMT, uma mutação também em heterozigose nos dois alvos do gene DXMT e nenhuma mutação observada no gene MXMT. Com os resultados obtidos, é possível concluir que a embriogênese direta é uma estratégia muito mais rápida de regeneração de embriões de cafeeiro e o genótipo parece ter forte influência no sucesso de estratégias de silenciamento gênico em C. canephora, assim como os genes a serem silenciados, que podem afetar o desenvolvimento das plantas editadas.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - LUCIANO VILELA PAIVA (Membro)
Interno - MARIO LUCIO VILELA DE RESENDE (Membro)
Interno - LEANDRO EUGENIO CARDAMONE DINIZ (Membro)
Externo à Instituição - NATÁLIA CHAGAS FREITAS - EMBRAPA (Membro)
Externo à Instituição - RAFAELI APARECIDA VIEIRA DE SOUZA - UFLA (Suplente)
Externo à Instituição - HUGO BRUNO CORREA MOLINARI - EMBRAPA (Membro)
Externo à Instituição - ANA DA SILVA LÉDO - EMBRAPA (Suplente)