Banca de DEFESA: TAMIRES LUANA SILVA

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: TAMIRES LUANA SILVA
DATA: 07/07/2020
HORA: 14:00
LOCAL: Videoconferência
TÍTULO:

Desenvolvimento de um protocolo de alta eficiência para obtenção e regeneração de protoplastos isolados a partir de suspensões celulares embriogênicas visando a edição gênica em Coffea canephora

PALAVRAS-CHAVES:

CRISPR, melhoramento genético, protoplastos, pH, regeneração, suspensão celular

PÁGINAS: 45
GRANDE ÁREA: Ciências Agrárias
ÁREA: Agronomia
RESUMO:

A tecnologia CRISPR-Cas9 é uma ferramenta de edição gênica direcionada utilizada por melhoristas da atualidade. Sua aplicação em espécies vegetais torna possível a obtenção de organismos geneticamente modificados livres de transgenes, dispensando grande parte da burocracia envolvida na liberação e comercialização destes espécimes juntamente com maior aceitação do público-alvo. Para tal, é necessário que a proteína Cas9 e o sgRNA sejam entregues ao meio intracelular de forma direta (RNPs) ou através de plasmídeo, dispensando a inserção de DNA exógeno no genoma hospedeiro. Contudo, a parede celular das células vegetais oferece resistência mecânica para acesso de moléculas ao interior da célula, sendo necessária a sua retirada das células receptoras (momento em que passam a ser denominadas protoplastos). Assim, é possível a entrada de componentes moleculares capazes de alterar as regiões alvo do genoma celular através da desestabilização da membrana plasmática. O emprego destas células vegetais desprovidas de parede celular associado a um protocolo eficiente de regeneração em plantas, permite a realização de estudos como expressão gênica, melhor entendimento do metabolismo celular, além da manipulação genética.

O alto custo da produção de café, longo ciclo da cultura e a valorização do produto à nível mundial, atrai investimentos de empresas do setor para o melhoramento genético da cultura, devido ao alto potencial de viabilização do desenvolvimento de novas cultivares com características comerciais desejáveis, uma vez que possibilita manipulações genéticas programáveis sem marcas de DNA exógeno no genoma hospedeiro em menor tempo quando comparado ao melhoramento convencional.

Este trabalho teve como objetivo a elaboração de um protocolo eficiente e reprodutível para obtenção de protoplastos da espécie diploide Coffea canephora (2n=2x=22), visando aplicação de tecnologia molecular de precisão para melhoramento vegetal.

Em decorrência da regeneração dos protoplastos em plantas ser um fator limitante da técnica, o isolamento de protoplastos deve ser realizado a partir de material biológico com alta capacidade totipotente, por exemplo, suspensões celulares embriogênicas. Sendo assim, protoplastos vegetais foram isolados a partir de suspensões de calos embriogênicos de Coffea canephora.

Para remoção parede celular das células vegetais foi realizada uma digestão enzimática utilizando dois tipos de combinação e concentração enzimáticas, são elas: 2% celulase, 1% driselase e 1% pectinase; e 1% celulase, 1% Macerozima e 0,4% pectinase. As células em suspensão, foram drenadas e imersas em mistura 1:1 de solução enzimática e meio BH3 0,7M sob agitação de 50 rpm por 14 horas em ausência de luz. Ambas as combinações apresentaram rendimento e viabilidade equivalentes.

A influência do pH da solução enzimática também foi verificada por meio de avaliação da viabilidade e concentração celular obtidas. Entre os valores de pH analisados (5.6, 6.0 e 6.5) foi constatado que o pH 5.6 proporcionou maior eficiência enzimática e viabilidade celular simultaneamente.

Em relação a regeneração, após 60 dias de plaqueamento, as células submetidas à redução de pressão osmótica, foram inoculadas em frascos erlenmeyers com capacidade para 25 ml, contendo 10 ml de meio líquido e 0,1 g de massa celular, mantidos sob agitação de 80 rpm, no escuro à 27 _{ }C. Foi avaliado através de análise histológica o desenvolvimento dos aglomerados celulares inoculados em meios EME, Yasuda e MS meia força modificados renovados cada 20 dias, uma vez que houve multiplicação celular em todos os meios de cultivo analisados. Até o presente momento, apenas o crescimento dos protoplastos em suspensão celular foi obtido.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - LUCIANO VILELA PAIVA (Membro)
Interno - RAFAELI APARECIDA VIEIRA DE SOUZA - UFLA (Suplente)
Externo à Instituição - BRENO RÉGIS SANTOS - UNIFAL (Membro)
Externo à Instituição - RODRIGO ROCHA LATADO - IAC (Membro)
Externo à Instituição - VANESSA CRISTINA STEIN - UFSJ (Suplente)